近日，壽仙谷與浙江中醫(yī)藥大學(xué)王興亞教授團隊合作，比較分析了去壁靈芝孢子粉（RSGLP）與破壁靈芝孢子粉（BSGLP）的抗胃癌作用，發(fā)現(xiàn)去壁靈芝孢子粉對胃癌細(xì)胞MKN28、NCI-N87、AGS均有顯著的抑制作用，且效果優(yōu)于破壁靈芝孢子粉。進一步研究發(fā)現(xiàn)，去壁靈芝孢子粉通過阻斷自噬通量誘導(dǎo)自噬小體積累，從而誘導(dǎo)AGS細(xì)胞凋亡。本研究為去壁靈芝孢子粉作為一種自噬抑制劑用于治療胃癌提供了理論依據(jù)。研究成果發(fā)表于國際學(xué)術(shù)期刊《ONCOLOGY LETTERS》。

采用MTT法檢測細(xì)胞活力，研究結(jié)果表明，在胃癌細(xì)胞MKN28、NCI-N87、AGS中，RSGLP的抑制作用均優(yōu)于BSGLP，且具有時間和劑量依賴性。另外，相對于MKN28、NCI-N87細(xì)胞系，AGS細(xì)胞對靈芝孢子粉更敏感（圖1）。

圖 1 破壁靈芝孢子粉多糖（BSGLP）、去壁靈芝孢子粉多糖（RSGLP）對MKN28、NCI-N87和AGS細(xì)胞活力的影響

本研究通過Hoechst 33342染色，觀察RSGLP對AGS細(xì)胞中凋亡小體形成的影響，并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測AGS細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果表明，RSGLP顯著增加AGS細(xì)胞中凋亡小體的數(shù)量（圖2A）；3.0和3.5 mg/ml的RSGLP處理AGS細(xì)胞24 h，早期凋亡細(xì)胞比例從4.93%增加到14.25%和14.99%；處理36 h，早期、晚期凋亡細(xì)胞比例均顯著增高（圖2B-C）。

Bcl-2、Caspase-3和PARP是凋亡途徑中的關(guān)鍵參與者。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果表明，RSGLP呈劑量依賴性下調(diào)Bcl-2和pro-Caspase-3的表達(dá)水平，上調(diào)PARP剪切蛋白的表達(dá)水平（圖2D）。

圖 2 RSGLP誘導(dǎo)AGS細(xì)胞凋亡

采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白(LC3 II和p62)的表達(dá)。RSGLP處理24 h，LC3 II和p62蛋白的表達(dá)水平均呈劑量依賴性顯著升高，提示RSGLP可誘導(dǎo)AGS細(xì)胞的自噬啟始并抑制自噬通量，從而誘導(dǎo)自噬小體積累。通過晚期自噬抑制劑CQ (5 μm)和自噬誘導(dǎo)劑Rap (2 μm)進一步驗證了RSGLP對自噬和自噬通量的影響（圖3）。

自噬體與溶酶體融合是細(xì)胞自噬的關(guān)鍵過程。為了進一步證實RSGLP抑制了AGS細(xì)胞的自噬通量，我們將mRFP-GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞，以監(jiān)測自噬體與溶酶體的融合。研究結(jié)果表明Rap增加AGS細(xì)胞自噬小體形成而不影響自噬通量；RSGLP和CQ均阻斷了自噬體與溶酶體融合，從而抑制了自噬通量（圖4）。

進一步分析了Rap和CQ對RSGLP誘導(dǎo)的AGS細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，Rap和CQ對AGS細(xì)胞的活力均無影響，但可顯著增加RSGLP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及PARP活化（圖5）。

圖 4 RSGLP阻斷自噬體與溶酶體融合圖 

圖 5 Rap和CQ對RSGLP誘導(dǎo)的AGS細(xì)胞凋亡的影響